Анотація до роботи:

Осташ І. С. Гени, які контролюють глікозилювання та експорт ландоміцинів у Streptomyces globisporus 1912 та Streptomyces cyanogenus S136. -Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.22 – молекулярна генетика. - Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2008.

Вивчено гени, що контролюють глікозилювання та транспортування ландоміцинів (La) з клітин продуцентів. У lnd-кластері Streptomyces globisporus відсутні гомологи генів lanGT3 та lanZ2 з lan-кластеру S. cyanogenus. Це зумовлює накопичення в S. globisporus LaЕ як кінцевого продукту. Очищено білки LanZ2 та LndGT4, що є базою для біохімії глікозилювання La. S. globisporus містить гени lndJ та lndW, що кодують протон- та АТФ-залежні транспортери, відповідно. За умов надекспресії ці гени надають стрептоміцетам підвищеної стійкості до La. S. cyanogenus містить гомолог lndJ – lanJ, що регулюється lanК. Показано in vivo та in vitro, що LanK репресує lanJ та низку генів глікозилювання за відсутності La з 3, 5 чи 6 цукрами. За певної концентрації ці La взаємодіють з LanK, дерепресують lanJ та гени глікозилювання і так підсилюють власний експорт та синтез.

У результаті виконаної роботи встановлено організацію і роль генів Streptomyces globisporus 1912 та S. cyanogenus S136, задіяних у пізніх етапах глікозилювання ландоміцинів та їхнього експорту. Відмінності в організації цих генів у згаданих штамів зумовлюють зміни у спектрі синтезованих ними ландоміцинів. Експресія генів транспортерів ландоміцинів підлягає транскрипційному контролю. Запропоновано використовувати репортерну систему на основі регуляторного гена lanK для виявлення сполук ландоміцинової родини. Розроблено методи надекспресії та очищення білків LndGT4 і LanZ2, які перспективні для використання у хемоензиматичному синтезі нових біологічно-активних сполук.

1. Клоновано та секвеновано гени lndJ lndZ1 lndZ3 Streptomyces globisporus 1912, задіяні у пізніх етапах глікозилювання ландоміцинів та їхнього експорту. У межах цієї групи не виявлено гомологів lanK, lanGT3 та lanZ2 з кластеру генів біосинтезу ландоміцину А S. cyanogenus S136, що зумовлює накопичення в S. globisporus ландоміцину Е як кінцевого продукту.

2. Підібрано оптимальні умови для надпродукції та очищення нуклеотидилтрансферази LanZ2.

3. Розроблено систему для надпродукції глікозилтрансферази LndGT4 у стрептоміцетних штамах на основі вектора рКС1139 та S. lividans.

4. Гени транспортерів lndJ та lndW надають стрептоміцетам стійкості до ландоміцину Е. Вони є активними під час синтезу ландоміцинів, проте не відіграють основної ролі у забезпеченні виживання S. globisporus за таких умов.

5. Регулювання експресїї гена lndJ у штамі S. globisporus 1912 важливе для синтезу ландоміцину Е як кінцевого вторинного метаболіту. Його надекспресія призводить до значного зниження вмісту ландоміцину Е, що є наслідком передчасного експорту інтермедіатів.

6. У S. cyanogenus експресія генів lanJ lanZ1 lanGT3 lanZ2 lanGT4 репресується білком LanK. Ландоміцини з довгими глікозидними ланцюгами (не менше 3-х вуглеводневих залишків) блокують репресорні властивості LanK. Запропоновано модель координації синтезу ландоміцинів та їхнього експорту з клітин.

7. Ген lanK може бути використано як компонент для створення репортерних систем виявлення відомих та нових сполук ландоміцинової родини з довгими глікозидними ланцюгами.

Публікації автора:

1. Kozarevska I. (Ostash I.) Biosynthesis of landomycin E deoxysugar part in Streptomyces globisporus 1912: sequencing and analysis of lndZ1 and lndZ3 genes / I. Kozarevska (I. Ostash), B. Ostash, M. Samborskyy, V. Fedorenko // Вісн. Львів. ун-ту. Сер. Біол. - 2004. - Т. 38. - С. 92-98. Особистий внесок здобувача - субклонування генів, аналіз нуклеотидних послідовностей.

2. Ostash B. Generation of landomycin D producing strain Streptomyces globisporus LD3 / B. Ostash, I. Kozarevska (I. Ostash), V. Fedorenko // Folia Microbiol.- 2005.- Vol. 50, №3. - P. 19-23. Особистий внесок здобувача - визначення спектра стійкості та залежності виживання штамів від ландоміцинів, порівняльний аналіз стійкості стрептоміцетів до ландоміцинів Е та D.

3. Ostash I. Proton-dependent transporter gene lndJ confers resistance to landomycin E in Streptomyces globisporus 1912 / I. Ostash, B. Ostash, S. Walker, V. Fedorenko // Генетика - 2007. - Т. 43, №8. - С. 1032-1037. Особистий внесок здобувача - клонування генів, конструювання штамів актиноміцетів із надекспресією гена транспортера lndJ, визначення стійкості до антибіотиків методом дифузії антибіотика в агар.

4. Ostash I. An ABC transporter encoding gene lndW confers resistance to landomycin E / I. Ostash, B. Ostash, A. Kobylyanskyy, M. Myronovskyy, T. Nakamura, S. Walker, V. Fedorenko // Arch. Microbiol. - 2008. -Vol. 189, №4. - P. 105-109. Особистий внесок здобувача - субклонування та експресія генів, визначення стійкості до ландоміцину Е, отримання подвійного lndW^-lndJ^- мутанта та його характеристика за стійкістю до ландоміцинів та змінами у їхньому синтезі; конструювання EGFP-залежних репортерних плазмід для дослідження активності промотора гена lndW.

5. Федоренко В.О. Генетичний контроль біосинтезу ландоміцину Е культурою Streptomyces globisporus 1912 / В. О. Федоренко, Б. О. Осташ, А. М. Лужецький, О. М. Громико, Ю. В. Ребець, І. С. Осташ, Л. О. Горбаль, А. М. Кобилянський, М. Л. Мироновський // Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології: Зб. наук. пр.- 2007.- C. 376 -380. Особистий внесок здобувача - конструювання штамів із пошкодженими та надекспресованими генами lanK та lanJ, хімічний аналіз продукції ландоміцинів мутантними штамами методами хроматографії та мас-спектрометрії.

6. Kozarevska I (Ostash I.). Interrelationship of landomycin E biosynthesis and it’s transport in Streptomyces globisporus / I. Kozarevska (I. Ostash), B. Ostash, Yu. Rebets, V. Fedorenko // I-й Укр. конгрес клітинної біології (Львів, 25-28 трав. 2004 р.): тези доп. – Л., 2004. – С. 105. Особистий внесок здобувача - конструювання штамів із пошкодженим геном lndJ, аналіз мутанта методами гібридизації за Саузерном; очищення ландоміцинів з клітин мутанта, їхній аналіз методом ТШХ.

7. Ребець Ю. В. Регуляція біосинтезу ландоміцинів та гени стійкості до них у Streptomyces globisporus 1912 / Ю. В. Ребець, Б. О. Осташ, А. М. Лужецький, І. С. Козаревська (І. С. Осташ), О. М. Громико, А. М. Кобилянський, Л. О. Дутко, У. Я. Мік, В. О. Федоренко // Х-й з’їзд Т-ва мікробіологів України (Одеса, 15-17 вер. 2004 р.): тези доп. – О., 2004. - С. 320. Особистий внесок здобувача - надекспресія генів lanJ та lndJ, дослідження стабільності клонованих генів у стрептоміцетах, вирощування рекомбінантних штамів у рідких середовищах з метою аналізу продукції ландоміцинів та інших вторинних метаболітів.

8. Козаревська І. С. (Осташ І. С.), Транспозонний мутагенез у продуцентів ландоміцинів Streptomyces globisporus 1912 та Streptomyces cyanogenus S136 / І. С. Козаревська, (І. С. Осташ), Б. О. Осташ, М. В. Самбір, В. О. Федоренко // Х-й з’їзд Т -ва мікробіологів України (Одеса, 15-17 вер. 2004 р.): тези доп. – О., 2004. - С. 332. Особистий внесок здобувача - конструювання транспозонної плазміди, відбір штамів із вставкою транспозону у випадкові локуси геному S. globisporus.

9. Мік У. Я. Вивчення функції генів lndJ та lndW у S. globisporus / У. Я. Мік, Ю. В. Ребець, І. С. Осташ, Б. О. Осташ, В. О. Федоренко // Биоразнообразие, экология, эволюция, адаптация: II междунар. научн. конф. студ. асп. молод. уч., посвящ. 140-летию Од. нац. ун-та (Одеса, 28-31 бер. 2005 р.): тези доп. – О., 2005. - С. 141. Особистий внесок здобувача - створення штамів із пошкодженим та надекспресованим геном lndW, підбір праймерів для отримання фізичного доказу інактивації гена lndW у геномі S. globisporus.

10. Мироновський М. Л. Розробка системи транспозонного мутагенезу у штамі Streptomyces globisporus 1912 / М. Л. Мироновський, І. С. Осташ, Ю. В. Ребець, Б. О. Осташ, В. О. Федоренко // Молодь і поступ в біології: І міжнар. конф. студ. аспір. (Львів, 11-14 квіт. 2005 р.): тези доп. – Л., 2005. - С. 132. Особистий внесок здобувача – конструювання плазміди для транспозонного мутагенезу, оптимізація умов мутагенезу, дослідження морфології та гібридизаційний аналіз транспозантів.

11. Ostash I. The gene lanZ2 encodes a nucleotidyltransferase putatively involved in the biosynthesis of TDP--deoxysugars during landomycin A biosynthesis / I. Ostash, M. Fedoryshyn, A. Luzhetskyy, B. Ostash, V. Fedorenko, A. Bechthold, S. Walker // 11-th Annual Boston Bacterial Meeting (Boston, 17-18 jun. 2005): abstracts – B., 2005. - P. 34. Особистий внесок здобувача – очищення та дослідження активності білка LanZ2 за допомогою його in vitro тестування за наявності різних фосфорильованих дезоксицукрів.

12. Сініченко Ж. Роль гена lanJ, що кодує протон-залежний антипортер у біосинтезі ландоміцинів Streptomyces cyanogenus S136 / Ж. Сініченко, І. Осташ, Б. Осташ, А. Бехтольд, В. Федоренко // Молодь і поступ в біології: ІІ міжнар. конф. студ. аспір. (Львів, 21-24 бер. 2006 р.): тези доп. – Л., 2006. - С. 157. Особистий внесок здобувача – конструювання плвзміди для надекспресії lanJ, комплементаційний та хімічний аналіз мутантних штамів S. globisporus та S. cyanogenus.

13. Ostash I. LanK: a transcriptional regulator of the landomycin exporter gene in Streptomyces cyanogenus S136 I. Ostash, B. Ostash, A. Bechthold, V. Fedorenko, S. Walker // 12-th Annual Boston Bacterial Meeting (Boston, 9-10 jun. 2006): abstracts – B., 2006. - P. 41. Особистий внесок здобувача – очищення з клітин E. coli та in vitro дослідження білка LanK за здатністю зв’язувати ДНК (промотор між lanK та lanJ) за наявності та відсутності ландоміцинів з різної довжини дезоксицукрового ланцюга.

14. Федоренко В. О. Cтворення штамів актиноміцетів – продуцентів антибіотиків за допомогою методів генетичної інженерії / В. О. Федоренко, Б. О. Осташ, А. М. Лужецький, Ю. В. Ребець, О. М. Громико, І. С. Осташ, Л. О. Дутко, А. М. Кобилянський // IX Український біохім. з’їзд (Харків, 24-27 жов. 2006 р.): тези доп. – Х., 2006. - С. 159. Особистий внесок здобувача – очищення та дослідження активності білка LndGT4 in vitro та in vivo з використанням ландоміцину D як акцепторного субстрату та активованих дезоксицукрів – як донорних.